La electroforesis es una técnica para la separacion de moleculas segun la movilidad de éstas en un campo électric. La separación puede realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte sólido (por ejemplo: electroforesis en papel o en acetato de celulosa), a través de una matriz porosa (electroforesis en gel), o bien en disolución (electroforesis libre). Dependiendo de la técnica que se use, la separación obedece en distinta medida a la carga electrica de las moléculas y a su masa.
La electroforesis se usa en una gran mayoría en la materia del ADN recombinante ya que nos permite saber la carga que poseen los polipéptidos, y separar los diferentes polipéptidos resultantes de las variaciones del experimento del ADN recombinante. La variante de uso más común para el análisis de mezclas de proteínas o de ácidos nucleicos utiliza como soporte un gel, habitualmente de agarosa o de poliacrilamida.
Los ácidos nucleicos ya disponen de una carga eléctrica negativa, que los dirigirá al polo positivo, mientras que las proteínas se cargan al unirse con sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de una manera dependiente de la masa molecular de la proteína. Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo elétrico, éstas se moverán y deberán ir pasando por la malla del gel (una red tridimensional de fibras cruzadas), por lo que pequeñas se moverán mejor, más rápidamente. Así las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán cerca del lugar de partida.
MOVIMIENTO IONICO EN UN CAMPO ELÉCTRICO
Durante el proceso de migración de una partícula cargada en un campo eléctrico, dependiendo de la carga neta ocurrirá lo siguiente:
- Si la partícula posee carga + se moverá hacia el cátodo.
- Si la partícula posee carga - se moverá hacia el ánodo.
- Si la partícula no posee carga no se moverá.
EQUIPO ELECTROFORÉTICO
COMPONENTES
- Fuente de alimentación.
- Dos electrodos: ánodo (+) y cátodo (-).
- Cubeta.
- Tampón de electroforesis.
- Soporte electroforético (gel).
Métodos electroforeticos zonales.
Son los más comunes, dada su alta aplicabilidad en
diferentes campos. Son útiles para lograr la separación de mezclas complejas.
Se aplican pequeñas cantidades de la disolución de proteínas a un soporte
sólido, que se impregna con una solución tampón. Los soportes son en
general polímeros y forman un gel poroso que restringe el movimiento de las
moléculas a través del medio durante la electroforesis y disminuyen los
flujos de convección del solvente.
Como soporte han sido utilizados papel
(celulosa), almidón, poliacrilamida, agarosa y acetato de celulosa, entre
otros.
El equipamiento requerido es simple,
fuente de poder, cubeta vertical u horizontal donde se colocan el soporte
y dos electrodos Los más utilizados son:
- Electroforesis en gel de poliacrilamida.
Los geles de poliacrilamida se forman
por polimerización de la acrilamida por acción de un agente entrecuzador,
es químicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de
forma rápida y reproducible. Forma, además, geles transparentes con estabilidad
mecánica, insolubles en agua, relativamente no iónicos y que permiten buena
visualización de las bandas durante un tiempo prolongado. Además tiene la
ventaja de que variando la concentración de polímeros, se puede modificar de
manera controlada en el tamaño del poro, lamentablemente cada vez se emplea
menos en diagnostico debido a su neurotoxocidad.
- Electroforesis en geles de
gradientes.
El uso de geles de poliacrilamida que tienen un
gradiente creciente de concentración de archilamida + bisacrilamida, y en
consecuencia un gradiente decreciente en el tamaño del poro, pueden tener
ventajas sobre los geles de concentraciones uniformes de acrilamida. En un gel
en gradiente la proteína migra hasta alcanzar una zona donde el tamaño de poro
impida cualquier avance. Una vez se alcanza el limite del poro no se produce
una migración apreciable aunque no se detiene completamente. Una de las
ventajas de este tipo de geles es que resuelve mejor las bandas pues las
concentra en regiones mas estrechas, además de incrementar el rango de
pesos moleculares que se pueden resolver en un mismo gel comparado con
los de una concentración fija.
- Electroforesis en geles de agarosa.
La agarosa es un polisacárido
(originalmente obtenido de algas, como el agar-agar, pero de composición
homogénea), cuyas disoluciones (típicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad
de permanecer liquidas por encima de 50 grados C y formar un gel, semisólido al
enfriarse. Este gel esta constituido por una matriz o trama tridimensional de
fibras poliméricas embebida en gran cantidad de medio líquido, que retarda el
paso de las moléculas, se usa usualmente para separar moléculas grandes de
alrededor 20.000 nucleótidos.
La electroforesis capilar se basa en los mismos
principios de las técnicas electroforeticas convencionales, pero utiliza
condiciones y tecnología distinta que nos permiten obtener una serie de
ventajas al respecto, Esta separación de péptidos realizada sobre un capilar de
silica fundida a potenciales elevados 20 a 30 Kv en un campo de 400 a 500 v/cm
refrigerados por aire.
La corriente electroendosmótica (FEO)
generada por los grupos silanol de la superficie interna del capilar da como
resultado una corriente plana del frente del líquido que contrasta con el
frente parabólico de la cromatografía líquida de alta resolución.
Esta técnica, habitualmente denominada
electroenfoque se basa en el desplazamiento de las moléculas en un
gradiente de pH. Las moléculas
amfotéricas, como los aminoácidos, se separan en un medio en el que existe una
diferencia de potencial y un gradiente de pH . La región del ánodo es Ácida y
la del cátodo es alcalina. Entre ambos se establece un gradiente de pH
tal que las moléculas que se han de separar tenga su punto isoeléctrico dentro
del rango. Las sustancias que inicialmente se encuentran en regiones de pH
inferior a su punto isoeléctrico estarán cargadas positivamente y migraran
hacia el cátodo, mientras aquellas que se encuentran en medios con pH más bajos
que su punto isoeléctrico tendrán carga negativa y migraran hacia el
ánodo. La migración les conducirá a una región dónde el pH coincidirá con
su punto isoléctrico, tendrán una carga neta nula y se detendrán.
- Electroforesis bidimensional.
La electroforesis bidimensional se basa
en separar las proteínas en una mezcla según sus dos propiedades moleculares, una
en cada dimensión. El procedimiento más usado se basa en la separación en una
primera dimensión mediante isoelectroenfoque y la segunda dimensión según peso
molecular mediante electroforesis en poliacrilamida.
FACTORES QUE AFECTAN LA ELECTROFORESIS
- Carga neta
- Tamaño
- Intensidad del campo eléctrica
- Temperatura
- Medio de soporte
- Buffer
BIBLIOGRAFIA
- http://es.wikipedia.org/wiki/Electroforesis
- http://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/inicio.htm
- https://oldearth.wordpress.com/2008/10/16/experimentos-de-biologia-molecular-1-electroforesis/
- https://biotechspain.com/es/tecnica.cfm?iid=1109tecnica_electroforesis
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